كلونينگ و تعيين توالي ژن كد كننده ليپوپروتئين سطحي LipL41 در باكتري لپتوسپيرا اينتروگانس سرووار گريپوتيفوزا

Cloning and Sequencing of Gene Encoding Outer Membrane Lipoprotein LipL41 of Leptospira Interrogans Serovar Grippotyphosa

زمينه و هدف: لپتوسپيروزيس يك بيماري عفوني مي باشد كه توسط سرووارهاي بيماريزاي لپتوسپيرا ايجاد مي شود. افزايش ارتقاي كيفي روش هاي كاربردي و معتبر در تشخيص اين بيماري و همچنين توليد واكسن نوتركيب ، نياز به آنتي ژن هاي اختصاصي دارد كه در بين سرووارهاي بيماريزاي لپتوسپيرا يكسان و مشابه است. پروتئين هاي غشاي خارجي لپتوسپيرا (OMPs)، آنتي ژن هاي موثري مي باشند كه قادر به تحريك پاسخ ايمني مشخص در دوره عفونت مي باشند. در بين اين آنتي ژن ها، LipL41 يك ليپو پروتئين ايمونوژنيك است كه تنها در سرووار هاي بيماريزا وجود دارد بنابراين مي توان آن را به عنوان كانديداي مناسبي در تهيه واكسن موثر و كارآمد و همچنين در روش هاي تشخيصي در نظر گرفت. به منظور تعيين ميزان حفاظت شدگي ژن lipL41، اين ژن در لپتوسپيرا اينتروگانس سرووار واكسينال و بومي گريپوتيفوزا كلون و تعيين توالي گرديد. مواد و روش ها: لپتوسپيرا اينتروگانس سرووار واكسينال و بومي گريپوتيفوزا جهت تلقيح در محيط كشت انتخابي(EMJH) مورد استفاده قرار گرفت و استخراج DNA ژنومي به روش استاندارد فنل كلروفرم انجام گرديد. ژن lipL41 با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي تكثير و در وكتور pTZ57R/T كلون گرديد و به سلول هاي مستعد شده E. coli سويه (Top10) انتقال داده شد. سپس پلاسميد نوتركيب استخراج و تعيين توالي گرديد. سكانس هاي مرتبط به منظور آناليز همولوژي با سكانس هاي ثبت شده در بانك ژني مقايسه شدند. يافته ها: محصول PCR ژن lipL41 يك قطعه 1065جفت بازي بود. كه اين قطعه در سرووار غير بيماريزا L. biflexa مشاهده نگرديد. بررسي توالي نوكلئوتيدي نشان داد كه قرابت نوكلئوتيدي ژن lipL41 بين سرووار واكسينال (RTCC2808) و سرووار بومي بيماريزاي (RTCC2825) گريپوتيفوزا 100% بود. نتيجه گيري: نتايج اين مطالعه نشان داد كه ژن lipL41 با 95/9% تشابه يك ژن حفاظت شده در سرووارهاي مختلف بيماريزا مي باشد. از اين رو ژن كلون شده در تحقيق حاضر را مي توان با هدف بيان پروتئين نو تركيب در تهيه واكسن نوتركيب موثر و كارآمد و در روش هاي تشخيصي لپتوسپيروزيس مورد هدف قرار داد.

Background: Leptospirosis is an infectious bacterial disease caused by pathogenic serovars of Leptospira. Development of reliable and applicable diagnostic test and also recombinant vaccine for this disease require specific antigens that are highly conserved among diverse pathogenic leptospiral serovars. Outer membrane proteins(OMPs) of leptospira are effective antigens which can stimulate remarkable immune responses during infection، among them LipL41 is an immunogenic lipoprotein which is present only in pathogenic serovars so it could be regarded as a good candidate for vaccine development and diagnostic method. In order to identify genetic conservation of the lipL41 gene، we cloned and sequenced this gen from Leptospira interrogans serovar vaccinal and field of Grippotyphosa. Materials and Methods: Leptospira interrogans serovar vaccinal Grippotyphosa (RTCC2808) and serovar field Grippotyphosa (RTCC2825)were used to inoculate into the selective culture medium(EMJH). The genomic DNA was extracted by standard phenol-chloroform method. The lipL41 gene were amplified by specific primers and cloned into pTZ57R/T vector and transformed into the competent E. coli (Top10) cells. the extracted recombinant plasmid were sequenced. and the related sequences were subjected to homology analysis by comparing them to sequences in the Genbank database. Results: PCR amplification of the lipL41 gene resulted in the 1065 bp PCR product. DNA sequence analysis revealed that lipL41 gene between serovar vaccinal Grippotyphosa (RTCC2808)and serovar field Grippotyphosa (RTCC2825) in Iran was 100%. It was also showed that the lipL41 gene had high identity (96%-100%) with other pathogenic serovars submitted in Genbank database. Conclusion: The results of this study showed that the lipL41 gene was highly conserved among various pathogenic Leptospira serovars( >95.9 % identity). Hence the cloned gene could be further used for expression of recombinant protein for serodiagnosis and also can be a good candidate for vaccine against leptospirosis